LED技術正讓我們的生活變得越來越精彩。過去的50年里，LED技術的應用已經從電子產品中簡單的指示燈擴展到了取代家用照明白熾燈,為地球節約了數以太(1012)瓦計的電力。基于其高亮度、高可控性及寬光譜輸出的特點，LED近期發展出了一些不為大家所熟知的專業照明應用。
熒光顯微技術在生命科學中運用廣泛，常常被用來研究生物樣本，包括單細胞到整個組織的樣本。這個過程涉及到利用光學顯微鏡使用特定波長的光束來刺激樣品。由于斯托克斯（Stokes）位移——物質被光激發后，產生的電子躍遷（熒光）中，其吸收譜和發射譜峰值間的波長差或頻率差，光束重新發射的熒光波長大于原激發光的波長。而把熒光顯微技術中傳統使用的燈泡換成LED光源，這一改變為該領域帶來的效益遠不止大大降低運行成本。
圖 熒光顯微鏡的基本構造。圖片來源：Luther Hindley/CoolLED公司
作用一：滿足光譜需求
有些研究需要使用活細胞成像，另一些需要使用被化學試劑固定于某一特定生命時期的細胞。不論何種情況，用于照明樣本的光源類型和設計對顯微鏡所需的硬件以及所記錄圖像的質量和有效性都有極大的影響。
早期使用LED系統的一個重要原因在于使用者及實驗管理的便利性。最常見的燈泡，例如100 W高壓汞燈，其壽命很短，約為300小時。使用者通常會在記事本上記錄打開燈泡的時間，因為如果使用燈泡的時間過長，會增加爆炸的風險。然而，LED產品的使用壽命長達數萬小時。
燈泡需要預熱與冷卻，而且一整天都要這樣。而LED光源可以在需要的時候以電子方式打開或關閉，即在觀察樣本或成像期間打開光源，不使用的時候關閉。盡管用LED光源替代燈泡的賣點很多，但同時存在高亮度及光譜范圍這兩個主要問題，LED光源最初并未被廣泛應用。
LED光源發出的光不是寬光譜而是半峰寬約10 nm至40 nm的類高斯光譜。因此光源設計人員要使用多個LED來滿足研究人員的光譜需求，這就帶來了光源設計過程中新的光電和機械復雜性，而這些問題對于傳統光源來說是不存在的。捕捉和校準LED芯片的朗伯發射，然后使用雙色鏡組合出多種顏色，這已經成為了標準方法。朗伯定律表明，從漫反射表面觀察到的發光強度與入射光和表面法線之間夾角θ的余弦值成正比。這種復雜性和損耗導致大多數LED光源最多能包含6種不同波長的光。
一種新穎且已獲得專利的方法采用了波長組概念，即具有相近光譜的LED光波長成為一個用戶可選擇的通道，根據對高速應用的需求，可以把四組光譜分離的LED組合在一起。但關鍵是，某些波長接近的分組，在相同的樣本中很少會同時用到。如今，研究人員可以使用包含16種波長的LED光源，使用這種方法能夠提高LED的亮度、譜段范圍，也能降低成本。
長期以來，燈泡光譜的綠光區域是最弱的，這部分區域在固態照明中被稱為“綠色缺口”，也是LED光譜中極其微弱的區域。一種解決方法是使用由一系列明亮藍色LED激發的熒光棒。與單芯片LED相比，在常見的熒光顯微鏡上使用這種方法會增加成本且使用不方便。對藍色LED芯片功率的最新研究提出了更為簡單的解決方案，即在LED上直接放置熒光劑，且只選擇能夠提供最大綠色光譜區域的熒光劑。下圖中展現了由明亮綠色LED通過斯托克斯位移激發的紅色光。
圖 使用熒光標記的牛肺動脈內皮細胞。藍色區域為細胞核，綠色區域為微管蛋白，紅色區域為肌動蛋白。圖片來源：Jordi Recasens/Izasa Scientific。
作用二：成像增強
顯微技術的最終目標是獲取優質圖像。LED由于其固態特性可作為顯微鏡附件直接使用，無需重新校準。采用科勒照明（一種現代科學光學顯微鏡下的樣品照明技術），光源中的光學器件可將LED成像到顯微鏡物鏡的后孔徑上。這種反向工作的物鏡能夠在樣品的完整視場內均勻地分散光線，然而一些LED系統仍使用導光板，以減輕顯微鏡的重量和振動。
具有良好的阻擋和傳輸區域的濾光片能夠改善圖像的信噪比。在用于DAPI（6-二脒基-2-苯基吲哚）熒光團成像的典型激發濾光片和發射濾光片中，激發濾光片要擋住汞（Hg）光譜中藍色區域的高能量光線。
圖 激發和發射濾光片系統中，385 nm LED光和Hg光譜與DAPI的吸收和發射光譜重疊情況。圖片來源：Gerard Whoriskey/CoolLED 公司。
相比之下，用于激發DAPI的LED在相應的激發帶上產生了極低的能量，包括在樣品成像相對較弱的藍色區域。對比結果為，使用LED作為光源能夠獲得更好的圖像信噪比，因為它減少了樣品的背景色階。愛丁堡大學的Sandrine Prost及其同事們的研究表明采用波長可控的獨立LED光源，其信噪比的提高超過了燈泡系統，甚至超過了一些白色寬頻譜LED光源。
同時，樣品觀測結果也會受觀察過程的影響，因為細胞不適合暴露在高強度光線下。不當光照的負面作用包括光漂白和光毒性，隨著時間推移，光照將導致信號減弱、活細胞死亡或行為異常。減少樣品的照明時間對降低這些負面效應至關重要。傳統燈泡光源通過機械快門來控制曝光，有時會造成長時間的延遲，導致樣品在相機的曝光時間內被不必要地照亮。
使用自動控制的LED光源則可以解決這個問題。LED的直接邏輯電路（TTL)控制達到了微秒量級的開/關時間，優于USB通信方式。許多高端相機在曝光時有TTL信號輸出，該信號可以直接反饋至LED光源，控制光源開/關，與相機曝光時間精確匹配。由于連續成像兩至三個熒光團很常見，所以最新的LED光源將波長序列編程到光源內，相機按順序依次進行曝光。這種電路連接方式減少了樣品不必要的曝光，而機械控制的快門或者電腦控制方法都沒有實時操作系統。
最近，高效節能的340 nm LED光源已經進入市場，可以進行鈣熒光指示劑（Fura-2）的成像。這項應用可以捕捉到神經網絡的活動以便對阿爾茨海默病和其它類似病癥進行研究。英國Strathclyde大學的Peter Tinning及其同事們的研究表明，使用340nm或380nm的強LED系統，可使細胞中Fura-2濃度比標準細胞制備方案低25%。該研究不僅為實驗研究節省了資金，更重要的是，能夠降低熒光標記可能導致的細胞毒性效應，以觀測到生物樣品更為典型的自然行為。
原文鏈接：
https://www.photonics.com/Article.aspx?AID=62272&PID=2&VID=143&IID=954
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