在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域,雙光子顯微成像(Two-Photon Microscopy, TPM)因其對(duì)深層組織的強(qiáng)成像能力、高分辨率和低光毒性,已成為神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤科學(xué)研究的重要工具。而飛秒激光器,尤其是950nm波長(zhǎng)的飛秒激光,因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),成為雙光子成像的理想光源。本文將深入探討950nm飛秒激光器在雙光子成像中的應(yīng)用及其技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
雙光子成像的基本原理
雙光子成像是一種非線性光學(xué)成像技術(shù),其核心原理是雙光子激發(fā)熒光(Two-Photon Excitation Fluorescence, TPEF)。與傳統(tǒng)單光子熒光成像不同,TPEF需要熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)(低能量)光子,達(dá)到激發(fā)態(tài)并發(fā)射熒光。由于雙光子吸收的概率與光強(qiáng)的平方成正比,因此只有激光焦點(diǎn)處的高強(qiáng)度區(qū)域才能產(chǎn)生有效熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)光學(xué)層析成像,減少背景噪聲。
Rainbow 950 HP 關(guān)鍵參數(shù):
激發(fā)波長(zhǎng):通常在950 nm-980 nm(近紅外波段),以降低組織散射和吸收。
脈沖寬度:<200 fs,窄脈寬設(shè)計(jì)可以有效提高峰值功率,提高雙光子激發(fā)效率。
平均功率:>300 mW,可有效避免光損傷,同時(shí)保證足夠的信號(hào)強(qiáng)度。
重復(fù)頻率:80 MHz,既能提供高峰值功率確保有效激發(fā),又不會(huì)因單脈沖能量過高而帶來明顯的非線性副作用或光損傷。
為什么選擇Rainbow 950 HP飛秒激光器?
在雙光子成像中,激發(fā)波長(zhǎng)的選擇至關(guān)重要。950nm飛秒激光器在多個(gè)方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì):
(1)深層組織穿透能力
生物組織對(duì)近紅外光(700-1100nm)的吸收和散射較低,而950nm波長(zhǎng)處于“光學(xué)窗口”的黃金區(qū)間,可穿透更深的區(qū)域(可達(dá)1mm以上),適用于大腦、皮膚、腫瘤等厚樣本成像。
(2)廣泛的熒光團(tuán)兼容性
許多常用熒光染料(如GFP、RFP)和鈣離子探針(如GCaMP)在950nm附近具有較高的雙光子吸收截面,使得950nm激光器能高效激發(fā)多種熒光標(biāo)記物。
(3)降低光毒性和光漂白
相比短波長(zhǎng)激光(如800nm),950nm光子能量更低,減少單光子激發(fā)導(dǎo)致的非特異性光損傷,同時(shí)飛秒脈沖的瞬時(shí)高峰值功率可降低平均功率需求,進(jìn)一步保護(hù)活體樣本。
(4)減少自發(fā)熒光干擾
生物組織在紫外-可見光范圍有較強(qiáng)的自發(fā)熒光,而950nm激發(fā)可有效避免這一干擾,提高信噪比(SNR)。
基于諾派激光Rainbow 950 HP的測(cè)試效果
Rainbow 950 HP飛秒激光器的核心優(yōu)勢(shì)
與普通鈦寶石可調(diào)諧激光器(如700-1000nm)相比,固定波長(zhǎng)950nm飛秒激光器在以下方面更具競(jìng)爭(zhēng)力:
(1)更高的穩(wěn)定性和可靠性
可調(diào)諧激光器需要復(fù)雜的波長(zhǎng)校準(zhǔn),而固定波長(zhǎng)950nm激光器結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單,輸出更穩(wěn)定,適合長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。
(2)緊湊型設(shè)計(jì),易于集成
Rainbow 950 HP系列飛秒激光器體積小、免維護(hù),可輕松整合到商用或自研雙光子顯微鏡系統(tǒng)中。
(3)成本效益
相比寬調(diào)諧范圍的鈦寶石激光器,Rainbow 950 HP系列飛秒激光器價(jià)格比主流寬調(diào)諧鈦寶石飛秒激光器的一半還要略低,具有優(yōu)越的性價(jià)比。
典型應(yīng)用案例
(1)神經(jīng)科學(xué)研究
活體大腦成像:950nm飛秒激光可穿透小鼠顱骨,實(shí)現(xiàn)皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元鈣信號(hào)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。
軸突和樹突動(dòng)態(tài)追蹤:結(jié)合GCaMP探針,研究突觸可塑性。
小鼠大腦皮層神經(jīng)元鈣離子信號(hào)的測(cè)試
(2)腫瘤微環(huán)境研究
腫瘤血管成像:利用950nm激發(fā)熒光蛋白標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察腫瘤血管生成及藥物響應(yīng)。
免疫細(xì)胞遷移:追蹤T細(xì)胞在腫瘤組織中的動(dòng)態(tài)行為。
(3)皮膚與眼科成像
皮膚膠原纖維觀測(cè):通過二次諧波成像(SHG)結(jié)合雙光子熒光,無創(chuàng)檢測(cè)皮膚老化或病變。
視網(wǎng)膜神經(jīng)元活動(dòng)記錄:適用于青光眼、視網(wǎng)膜退行性疾病研究。
結(jié)語
Rainbow 950 HP飛秒激光器憑借其深層穿透、低光毒性、高穩(wěn)定性和廣泛兼容性,已成為雙光子成像的核心光源。無論是神經(jīng)科學(xué)、腫瘤學(xué)還是臨床前研究,它都能提供卓越的成像性能。隨著技術(shù)的進(jìn)步,Rainbow 950 HP飛秒激光器將繼續(xù)推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)成像的邊界,幫助科學(xué)家揭示更多生命奧秘。
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