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為了監(jiān)測(cè)神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)而理解神經(jīng)系統(tǒng)的功能機(jī)制，科學(xué)家們研發(fā)了不少高大上的“武器”。
近日，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》期刊報(bào)道了一項(xiàng)新研究成果。研究人員開發(fā)了一種可用近紅外光激發(fā)的電壓熒光納米探針，并用它成功監(jiān)測(cè)了斑馬魚和小鼠腦中神經(jīng)元膜電位的動(dòng)態(tài)變化。活體監(jiān)測(cè)時(shí)，這種新“武器”表現(xiàn)不俗。
設(shè)計(jì)電壓敏感探針一直是個(gè)技術(shù)難關(guān)
群體神經(jīng)元活動(dòng)的在體監(jiān)測(cè)是揭示神經(jīng)系統(tǒng)功能機(jī)制的關(guān)鍵。目前，神經(jīng)元鈣離子熒光成像是主要手段之一。然而，相比于神經(jīng)脈沖信號(hào)，鈣離子熒光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)相對(duì)較慢，且很難推斷出與之對(duì)應(yīng)的神經(jīng)脈沖的頻率和數(shù)量。因此，神經(jīng)科學(xué)界迫切期望能開發(fā)出對(duì)細(xì)胞膜電位變化敏感、有高信噪比的納米粒子或分子探針，從而實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率、大范圍神經(jīng)元集群電活動(dòng)的活體監(jiān)測(cè)。
現(xiàn)有的熒光電壓探針多用紫外光或可見光激發(fā)，由于這兩種光在活組織中易于吸收和散射，因此它們只能應(yīng)用于大腦淺層。相比于可見光或紫外光，紅外光（750納米—l000納米）在生物組織中穿透能力更強(qiáng)，穿透深度可達(dá)厘米量級(jí)，能夠應(yīng)用于大腦深層，被稱為“生物組織的光學(xué)窗口”。“因此，如何研發(fā)高靈敏、可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針已成為目前國(guó)際神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域迫切希望攻克的技術(shù)難關(guān)之一。”中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心/神經(jīng)科學(xué)研究所研究員杜久林對(duì)科技日?qǐng)?bào)記者說。
稀土元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒（UCNPs）是一類近紅外光激發(fā)，紫外、可見光多重發(fā)射的反斯托克斯發(fā)光納米材料。所謂反斯托克斯，即指物質(zhì)的發(fā)射光波長(zhǎng)短于激發(fā)光波長(zhǎng)的反常現(xiàn)象。由于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒具有低背景熒光、多重發(fā)射的特性，已在生物成像與活體診療的應(yīng)用中獲得廣泛關(guān)注。
在這項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)和制備了一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的電壓敏感探針。研究人員首先將上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒固定在細(xì)胞膜上，然后將六硝基二苯胺（DPA）嵌入細(xì)胞膜磷脂雙分子層。在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，帶負(fù)電荷的六硝基二苯胺在細(xì)胞膜外側(cè)富集，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離在10納米以內(nèi)，形成發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（FRET），上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒發(fā)光被六硝基二苯胺吸收，檢測(cè)到的光信號(hào)較弱。當(dāng)細(xì)胞去極化后，六硝基二苯胺在電場(chǎng)作用下于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)富集，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離超過10納米，發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)消失，從而恢復(fù)了上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的發(fā)光。
探究活體組織中神經(jīng)元活動(dòng)有了新思路
為驗(yàn)證新研發(fā)的電壓納米探針在神經(jīng)元電活動(dòng)檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，研究人員應(yīng)用該納米探針分別監(jiān)測(cè)了斑馬魚前腦神經(jīng)元的嗅覺反應(yīng)和小鼠新皮層神經(jīng)元膜電位振蕩隨麻醉深度的變化。
神經(jīng)元的電活動(dòng)動(dòng)態(tài)性強(qiáng)，以往開發(fā)的基于熒光蛋白的電壓探針信噪相對(duì)較低，大都需要多次疊加才能得到清晰的感覺反應(yīng)。同時(shí)，此類探針易被熒光淬滅，因此可記錄時(shí)間窗口較短，限制了其實(shí)用性。
“我們運(yùn)用新開發(fā)的電壓納米探針，研究了斑馬魚前腦神經(jīng)元對(duì)食物刺激的反應(yīng)。在近紅外光激發(fā)下，單次施加食物刺激即可顯著增強(qiáng)神經(jīng)元的熒光信號(hào)，并可在連續(xù)數(shù)次刺激下穩(wěn)定記錄。更重要的是，得益于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒較低的淬滅程度，活體記錄時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)30分鐘，為數(shù)據(jù)收集提供了充足的時(shí)間窗口。”杜久林向記者介紹。
哺乳動(dòng)物神經(jīng)元膜電位的閾下振蕩，反映了動(dòng)物個(gè)體的腦狀態(tài)及其變化。在深度睡眠和麻醉狀態(tài)下，腦狀態(tài)主要是慢波；在動(dòng)物趨于清醒時(shí)，慢波減弱甚至消失，代之以高頻電活動(dòng)。傳統(tǒng)的鈣離子成像反映的神經(jīng)活動(dòng)難以體現(xiàn)這種閾下膜電位振蕩，研究人員在小鼠初級(jí)體感皮層中注入電壓納米探針，并考察了戊巴比妥麻醉不同深度下的神經(jīng)元閾下膜電位活動(dòng)。在深度麻醉狀態(tài)下，納米探針發(fā)光存在低頻振蕩現(xiàn)象，提示此狀態(tài)下閾下膜電位以慢波為主。通過機(jī)械刺激小鼠尾巴提高其清醒水平后，納米探針發(fā)光的低頻振蕩減弱，高頻電活動(dòng)相對(duì)增強(qiáng)，在10分鐘后恢復(fù)至原有水平。此現(xiàn)象說明納米探針的發(fā)光強(qiáng)度可真實(shí)反映腦電活動(dòng)的相應(yīng)變化。
對(duì)此，杜久林表示，這項(xiàng)研究為設(shè)計(jì)可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針提供了全新思路，為探究深層活體組織中群體神經(jīng)元活動(dòng)開辟了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的新方法。
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