像差問題一直困擾著光學領域的工作者。像差會使光波前發生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時候我們只能“霧里看花”，更甚者，產生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重，因為在那里，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實現活體，例如小鼠大腦皮層，深層區域的高質量成像成為光學成像發展中最具挑戰性的問題之一。
美國Howard Hughes Medical Institute （霍華德·休斯醫學研究所）在Janelia Farm Research Campus的吉娜博士小組與來自中國科學院上海光學精密機械研究所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士最近成功將一種新的自適應光學的方法和雙光子顯微鏡結合，研制出一種新的自適應光學雙光子熒光顯微鏡。通過校正活體小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數倍的成像分辨率和信號強度，大大改進了成像質量，使得原來在活體鼠腦中不可見或者模糊的細節變得清晰可見，她們成功將該方法應用于老鼠視覺皮層第五層（約500µm）的形貌結構成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應光學方法，首次使得在活體小鼠深層區域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現實。這一成果以Multiplexed aberration measurement for deep tissue imaging in vivo 為題發表在最新一期的Nature Methods （《自然·方法》）雜志上 （Published online 17 August 2014; doi:10.1038/nmeth.3068）。
在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調制器將入射光分成若干子區域，每一塊子區域的波前都可以被獨立控制。同時，她們用數字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調制其中一半子區域的入射光強度，以另一半子區域作為“參考波前”。來自所有子區域光束會在焦點處會聚干涉，通過監測焦點激發的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調制的每一塊子區域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現對一半子區域波前的并行測量。對另一半子區域重復這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內的成像質量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區域的生物、醫學問題提供了可行性方案。
科學家研制成功新型自適應光學雙光子熒光顯微鏡
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